kelas XII menganalisis teknik pembuatan media kultur jaringan tanaman

Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar umum-nya diambil dari nama penemunya atau peneliti yang pertama kali dalam kultur yang khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya. Sedangkan media perlakuan adalah media dasar yang sudah mengalami penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT) sesuai dengan jenis tanaman yang akan di kultur.

Berikut beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain:

1. Media Murashige dan Skoog (MS) (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur, terutama untuk tanaman herbaceous.
2. Media dasar Gamborg B5 untuk kultur sel kedelai, alfalfa dan legume lain.
3. Media dasar White (1934) yang sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat.
4. Media dasar Vacin dan Went (VW) (1949) yang biasa digunakan untuk kultur tanaman anggrek.
5. Media dasar Nitsch dan Nitsch (1969) yang biasa digunakan untuk kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel.
6. Media dasar Schenk dan Hildebrandt (SH) (1972) yang cocok untuk kultur jari-ngan tanaman-tanaman monokotil.
7. Media dasar Woody Plant Medium (WPM) (1981) yang khusus untuk kultur tanaman berkayu.
8. Media dasar N6 (1975) untuk serealia terutama padi.

Dari sekian banyak media dasar yang paling sering dan banyak digunakan adalah komposisi media dari Murashige dan Skoog. Kadang-kadang untuk kultur tertentu kombinasi zat kimia dari Murashige dan Skoog masih tetap digunakan tetapi konsentrasinya diubah. Sebagai contoh media ½ MS, berarti konsentrasi per-senyawaan yang digunakan adalah setengah konsentrasi media MS.

PEMBUATAN MEDIA

Dalam membuat media, langkah pertama adalah membagi senyawa penyusun media ke dalam masing-masing kelompok larutan stok sesuai dengan sifat dan tingkat kelarutannya. Tujuan pembuatan larutan stok adalah untuk menghemat dan memudahkan pekerjaan menimbang bahan kimia setiap kali pembuatan media. Stok vitamin tidak dapat disimpan lama, umumnya dibuat untuk digunakan dalam 1 - 2 minggu. Stok hormon dapat disimpan antara 2 – 4 minggu. Sedangkan stok hara dapat disimpan 4 – 8 minggu. Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya dilakukan hanya dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja. 

Hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan larutan stok adalah mengenai penyimpanan larutan. Larutan yang sudah mengalami pengendapan tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan larutan stok biasa terjadi bila kepekatan larutan ter-lalu tinggi atau pengadukannya tidak rata. Oleh karena itu pengendapan larutan dapat dihindari dengan membuat larutan stok tidak terlalu pekat dan membuat campuran larutan stok sesuai dengan kelompoknya. Larutan stok dikelompokkan dalam :

Larutan stok A untuk persenyawaan KNO3

Larutan stok B untuk persenyawaan NH4NO3

Larutan stok C untuk persenyawaan KH2PO4 dan MgSO4

Larutan stok D untuk persenyawaan CaCl2

Larutan stok E untuk persenyawaan FeSO4 dan Na2EDTA

Larutan stok F untuk persenyawaan MnSO4, ZnSO4, H3BO3, KI, Na2MoO4, CoCl2, dan CuSO4

Larutan stok G untuk vitamin; thiamine HCl, Nicotinic acid, pyridoxin, dan glycine

Larutan stok H untuk myo inositol

Larutan stok A 

1 liter (50 x konsentrasi, ambil 20 ml)

Dalam 1 liter media, KNO3 dibutuhkan sebanyak 1.900 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 50 kali, maka KNO3 yang harus di-larutkan adalah 50 x 1.900 mg/l = 95.000 mg/l atau 95 g/l.

Kemudian larutkan dalam 700 ml aquadest, aduk-aduk sampai larut.

Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.

Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’A’.

Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok A 20 ml.

Larutan stok B

1 liter (50 x konsentrasi, ambil 20 ml)

Dalam 1 liter media, NH4NO3 dibutuhkan sebanyak 1.650 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 50 kali, maka NH4NO3 yang harus dilarutkan adalah 50 x 1.650 mg/l = 82.500 mg/l atau 82,5 g/l.

Kemudian larutkan dalam 700 ml aquadest, aduk sampai larut.

Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.

Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’B’.

Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok B 20 ml.

Larutan stok C

 1 liter (100 x konsentrasi, ambil 10 ml)

Dalam 1 liter media, KH2PO4 dibutuhkan sebanyak 170 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 100 kali, maka KH2PO4 yang harus dilarutkan adalah 100 x 170 mg/l =17.000 mg/l atau 17 g/l. MgSO4 dibutuhkan sebanyak 180,5 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 100 kali, maka MgSO4 yang harus dilarutkan adalah 100 x 180,5 mg/l =18.500 mg/l atau 18,5 g/l.

Kemudian larutkan secara terpisah kedua senyawa tersebut dalam 350 ml aquadest, aduk sampai larut.

Setelah larut sempurna, campurkan kedua senyawa tersebut dan tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.

Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’C’.

Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok C 10 ml.

Larutan stok D

 1 liter (100 x konsentrasi, ambil 10 ml)

Dalam 1 liter media, CaCl2 dibutuhkan sebanyak 332.02 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 100 kali, maka CaCl2 yang harus di-larutkan adalah 100 x 332,02 mg/l =33.200 mg/l atau 33,2 g/l.

Kemudian larutkan senyawa tersebut dalam 700 ml aquadest, aduk sampai larut.

Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.

Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’D’.

Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok D 10 ml.

Larutan stok E

 1 liter (200 x konsentrasi, ambil 5 ml)

Dalam 1 liter media, FeSO4 dibutuhkan sebanyak 27,8 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 200 kali, maka FeSO4 yang harus di-larutkan adalah 200 x 27,8 mg/l = 5.560 mg/l atau 5,56 g/l. Na2EDTA dibutuhkan sebanyak 37,3 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 200 kali, maka Na2EDTA yang harus dilarutkan adalah 200 x 37,3 mg/l =7.460 mg/l atau 7,46 g/l.

Kemudian larutkan secara terpisah kedua senyawa tersebut dalam 350 ml air aquadest yang hangat atau panas dan aduk sampai larut.

Setelah larut sempurna, campurkan Na2EDTA ke dalam botol FeSO4 secara perlahan-lahan sambil diaduk dan tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.

Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’E’.

Erlenmeyer atau botol seluruh sisi-sisinya harus ditutup dengan alumunium foil atau kertas koran, karena larutan Fe ini peka terhadap cahaya.

Setelah dingin, simpan dalam lemari es.

Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok E 5 ml.

Larutan stok F

 1 liter (200 x konsentrasi, ambil 5 ml)

Dalam 1 liter media, dibutuhkan MnSO4 16,9 mg/l, ZnSO4 8,6 mg/l, H3BO3 6,2 mg/l, KI 0,83 mg/l, Na2MoO4 0,25 mg/l, CoCl2 0,025 mg/l, dan CuSO4 0,025 mg/l. Untuk larutan stok 1 liter dengan konsentrasi 200 kali, maka bahan-bahan tersebut harus diambil sebanyak; MnSO4 3.380 mg/l, ZnSO4 1.720 mg/l, H3BO3 1.240 mg/l, KI 166 mg/l, Na2MoO4 50 mg/l, CoCl2 5 mg/l, dan CuSO4 5 mg/l.

Timbang dan larutkan senyawa-senyawa tersebut satu persatu sambil diaduk hingga larut dalam 700 ml aquadest. Jangan memasukkan senyawa berikut-nya sebelum senyawa yang diaduk larut.

Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.

Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’F’.

Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok F 5 ml.

Larutan stok G 

100 ml (100 x konsentrasi, ambil 1 ml)

Dalam 1 liter media, dibutuhkan thiamine 0,1 mg/l, Nicotinic acid 0,5 mg/l, pyridoxin 0,5 mg/l, dan glycine 2 mg/l. Untuk larutan stok 100 ml dengan konsentrasi 100 kali, maka bahan-bahan tersebut harus diambil sebanyak; thiamine 10 mg/l, Nicotinic acid 5 mg/l, pyridoxin 5 mg/l, dan glycine 200 mg/l.

Timbang dan larutkan senyawa-senyawa tersebut satu persatu sambil diaduk hingga larut dalam 50 ml aquadest. Jangan memasukkan senyawa berikutnya sebelum senyawa yang diaduk larut.

Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 100 ml.

Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’G’.

Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok G 1 ml.

Larutan stok H

 200 ml (20 x konsentrasi, ambil 10 ml)

Dalam 1 liter media, myo inositol dibutuhkan sebanyak 100 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 20 kali, maka myo inositol yang harus dilarutkan adalah 20 x 100 mg/l = 2.000 mg/l atau 2 g/l.

Kemudian larutkan dalam 100 ml aquadest, aduk sampai larut.

Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 200 ml.

Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’H’.

Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok H 10 ml.

9. Larutan stok zat pengatur tumbuh

Zat pengatur tumbuh, umumnya hanya dibutuhkan dalam jumlah sedikit. Proses penimbangan zat pengatur tumbuh untuk larutan stok, sulit digeneralisasi-kan. Karena biasanya zat pengatur tumbuh merupakan perlakuan dalam media kultur jaringan. Larutan stok dibuat dengan kepekatan 1 – 10 mg/ml. Berikut ini akan diuraikan pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh dengan kepekatan 1 mg/ml sebanyak 100 ml.

a. Larutan stok auksin (IAA, IBA, NAA dan 2,4-D)

Timbang bahan sebanyak 100 mg, kemudian tuangkan ke dalam gelas piala ukuran 100 ml yang berisi aquadest 50 ml. Sambil diaduk-aduk, teteskan sedikit demi sedikit larutan NaOH 1N hingga larut benar. Setelah larut merata, volume ditepatkan 100 ml menambah aquadest. Larutan yang telah ditepatkan volume-nya ini dapat dipindah ke botol lain dan diberi label. Untuk membuat 1 liter media dengan perlakuan hormon auksin 1 ppm, maka dibutuhkan 1 ml larutan stok hormon.

b. Larutan stok sitokinin (BAP, dan kinetin)

Timbang bahan sebanyak 100 mg, kemudian tuangkan ke dalam gelas piala ukuran 100 ml yang berisi aquadest 50 ml. Sambil diaduk-aduk, teteskan sedikit demi sedikit larutan HCl 1N hingga larut benar. Setelah larut merata, volume ditepatkan 100 ml menambah aquadest. Larutan yang telah ditepatkan volume-nya ini dapat dipindah ke botol lain dan diberi label. Untuk membuat 1 liter media dengan perlakuan hormon sitokinin 1 ppm, maka dibutuhkan 1 ml larutan stok hormon.

Apabila hormon sukar untuk larut, aquadest dapat dipanaskan sampai men-didih terlebih dahulu. Kemudian digunakan untuk melarutkan hormon dengan ditambahkan zat pelarut (HCl atau NaOH) sedikit demi sedikit sambil diaduk hingga larut.