Lompat ke konten Lompat ke sidebar Lompat ke footer
Beranda / Pembiakan dan Kultur Jaringan Tanaman

(KLS XII BAB 1) TEKNIK PENYIAPAN PERALATAN KULTUR JARINGAN TANAMAN

Posting Komentar
TEKNIK PENYIAPAN PERALATAN KULTUR JARINGAN TANAMAN

KD : 3.13 Menganalisis teknik penyiapan laboratorium kultur jaringan tanaman hortikultura

Kultur jaringan adalah : suatu metode memperbanyak tanaman menggunakan sel atau jaringan tanaman secara aseptik.
Pertumbuhan eksplan dalam kultur jaringan diusahakan dalam lingkungan yang aseptik dan terkendali. Laboratorium yang efektif merupakan salah satu unsur penting yang ikut menentukan keberhasilan pekerjaan, baik untuk penelitian, mau-pun produksi. Laboratorium sebaiknya dibangun di daerah yang udaranya bersih, tidak banyak debu dan polutan. Bangunan laboratorium kultur jaringan sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainnya, tetapi mudah saling berhubungan dan mudah dicapai.
Pembagian ruangan laboratorium kultur jaringan berdasarkan kegiatan-kegiatannya adalah sebagai berikut :
  1. Ruang persiapan/preparasi
  2. Ruang transfer/tanam
  3. Ruang kultur/inkubasi
  4. Ruang stok/media jadi
  5. Ruang timbang/bahan kimia

Ruang Persiapan

Ruang ini dipergunakan untuk mempersiapkan media kultur dan bahan tanaman yang akan dipergunakan, sebagai tempat mencuci alat-alat laboratorium, dan tempat untuk menyimpan alat-alat gelas. Sesuai dengan fungsinya, maka di-ruangan ini terdiri dari :
  1. Hot plate dengan magnetic stirer
  2. Oven
  3. Pengukur pH, dapat berupa pH meter, atau kertas pH indikator
  4. Autoklaf
  5. Kompor gas
  6. Tempat cuci
  7. Labu takar, gelas piala, erlenmeyer, pengaduk gelas, spatula, petridish, pipet, botol kultur, pisau scapel.

Ruang Transfer/Tanam

Ruang transfer merupakan ruang di mana pekerjaan aseptik dilakukan. Dalam ruangan ini dilakukan kegiatan isolasi tanaman, sterilisasi dan penanaman eksplan dalam media. Ruangan ini sedapat mungkin bebas dari debu dan hewan kecil, serta terpisah dan tersekat dengan ruangan lain. Penggunaan AC sangat dianjurkan dalam ruangan ini. Ruang transfer dilengkapi peralatan sebagai berikut :
  1. Laminar air flow cabinet, bisa juga enkas
  2. Alat-alat diseksi; pisau bedah/scapel, pinset, spatula, dan gunting.
  3. Hand sprayer yang berisi alkohol 70 %
  4. Lampu bunsen

Ruang Kultur/Inkubasi

Merupakan ruang yang paling besar dibanding dengan ruangan yang lain. Ruangan ini harus dijaga kebersihannya dan sedapat mungkin dihindari terlalu banyak keluar masuknya orang-orang yang tidak berkepentingan. Ruangan ini berisi rak-rak kultur yang berfungsi untuk menampung botol-botol kultur yang berisi tanaman. Rak ini juga dilengkapi dengan lampu-lampu sebagai sumber cahaya bagi tanaman kultur. Selain rak kultur, ruang kultur juga harus dilengkapi dengan AC, pengukur suhu dan kelembapan, serta timer yang digunakan untuk menghidup-kan dan mematikan lampu secara otomatis.
Cahaya yang digunakan sebagai penerangan, sebaiknya cahaya putih yang dihasilkan dari lampu flourescent. Lampu flourescent dipakai karena sangat baik dan sangat efisien dalam penggunaan energi bila dibanding dengan lampu pijar. Karena pada lampu pijar, hampir 90 % merupakan energi panas, sehingga mem-pengaruhi ruangan.
Intensitas cahaya yang baik dari lampu flourescent adalah antara 100 – 400 ftc (1000 – 4000 lux). Intensitas cahaya dapat diatur dengan menempatkan jumlah lampu dengan kekuatan tertentu.
Lampu yang digunakan bisa berupa lampu TL dengan daya 15 watt atau 40 watt, tergantung panjang rak yang dibuat. Jarak antar rak 30 – 35 cm. Sebaiknya travo pada lampu TL dipasang terpisah dari box, (lebih baik kalau dipasang di luar ruang kultur), karena dapat membakar tanaman kultur dan membuat suhu ruang menjadi panas.
Selain lampu TL, lampu SL juga dapat dipakai. Pemakaian lampu ini dapat meng-hemat biaya listrik, juga lebih terang. Tinggi rak yang dibuat antara 50 – 60 cm. Dalam satu bidang rak dapat memakai 2 atau 3 lampu SL daya 5 – 10 watt tergantung ukuran panjang rak.
Panjang penyinaran/lama penyinaran yang dibutuhkan oleh tiap tanaman berbeda-beda. Berapa lama penyinaran harus diberikan, tergantung pada jenis tanaman dan respon yang diinginkan. Ada kultur yang membutuhkan waktu pe-nyinaran yang terus menerus, ada yang 14 – 16 jam/hari, ada yang 10 – 12 jam/hari. Rata-rata waktu penyinaran yang efektif adalah 12 – 16 jam/hari.
Suhu ruang kultur diatur pada suhu 25 – 28o C. Pada suhu yang terlalu dingin, kultur kadang tidak berkembang dengan baik, begitu juga jika suhu ruang kultur terlalu panas, maka jamur dan bakteri akan berkembang biak dengan cepat dan tanaman menjadi layu.

Ruang stok/media jadi

Ruangan ini berfungsi sebagai ruang untuk menyimpan media tanam yang sudah di autoklaf. Ruang stok sebaiknya dingin dan gelap, serta kebersihannya harus dijaga. Media tanam akan diinkubasi pada ruang ini selama 3 hari sebelum digunakan. Hal ini untuk mengetahui kondisi media tanam apakah steril atau ter-kontaminasi jamur/bakteri. Apabila media terkontaminasi, sebaiknya segera dikeluar-kan dan diautoklaf selama 1 jam pada tekanan 0.14 Mpa.

Denah lengkap ruangan laboratorium kultur jaringan


Ruang Timbang/Bahan Kimia

Ruang ini berisi stok bahan-bahan kimia, timbangan analitik, magnetik stirer dan lemari es. Semua kegiatan penimbangan bahan kimia dan pembuatan larutan stok dilakukan di ruangan ini.

Berikut skema laboratorium kultur jaringan yang mempunyai 5 ruang sesuai dengan tahapan dan fungsinya masing-masing :
Sedangkan pada laboratorium sederhana, ruang tanam, ruang kultur dan ruang stok media dapat digabung menjadi satu ruangan. Sedangkan ruang preparasi /per-siapan dapat digabung dengan ruang bahan kimia (seperti dalam gambar di bawah). Dari 2 ruangan ini, ruang tanam + kultur harus memakai AC. Untuk daerah yang bersuhu dingin, tanpa memakai AC tidak ada masalah.
Komposisi media kultur jaringan

Pada umumnya media kultur jaringan dibedakan menjadi media dasar dan media perlakuan. Resep media dasar adalah resep kombinasi zat yang mengandung hara esensial (makro dan mikro), sumber energi dan vitamin. Dalam teknik kultur jaringan dikenal puluhan macam media dasar. Penamaan resep media dasar umum-nya diambil dari nama penemunya atau peneliti yang pertama kali dalam kultur yang khusus dan memperoleh suatu hasil yang penting artinya. Sedangkan media perlakuan adalah media dasar yang sudah mengalami penambahan zat pengatur tumbuh (ZPT) sesuai dengan jenis tanaman yang akan di kultur.
Berikut beberapa media dasar yang banyak digunakan antara lain:
  1. Media Murashige dan Skoog (MS) (1962) yang dapat digunakan untuk hampir semua jenis kultur, terutama untuk tanaman herbaceous.
  2. Media dasar Gamborg B5 untuk kultur sel kedelai, alfalfa dan legume lain.
  3. Media dasar White (1934) yang sangat cocok untuk kultur akar tanaman tomat.
  4. Media dasar Vacin dan Went (VW) (1949) yang biasa digunakan untuk kultur tanaman anggrek.
  5. Media dasar Nitsch dan Nitsch (1969) yang biasa digunakan untuk kultur tepung sari (pollen) dan kultur sel.
  6. Media dasar Schenk dan Hildebrandt (SH) (1972) yang cocok untuk kultur jari-ngan tanaman-tanaman monokotil.
  7. Media dasar Woody Plant Medium (WPM) (1981) yang khusus untuk kultur tanaman berkayu.
  8. Media dasar N6 (1975) untuk serealia terutama padi.
Dari sekian banyak media dasar yang paling sering dan banyak digunakan adalah komposisi media dari Murashige dan Skoog. Kadang-kadang untuk kultur tertentu kombinasi zat kimia dari Murashige dan Skoog masih tetap digunakan tetapi konsentrasinya diubah. Sebagai contoh media ½ MS, berarti konsentrasi per-senyawaan yang digunakan adalah setengah konsentrasi media MS.

PEMBUATAN MEDIA
Dalam membuat media, langkah pertama adalah membagi senyawa penyusun media ke dalam masing-masing kelompok larutan stok sesuai dengan sifat dan tingkat kelarutannya. Tujuan pembuatan larutan stok adalah untuk menghemat dan memudahkan pekerjaan menimbang bahan kimia setiap kali pembuatan media. Stok vitamin tidak dapat disimpan lama, umumnya dibuat untuk digunakan dalam 1 - 2 minggu. Stok hormon dapat disimpan antara 2 – 4 minggu. Sedangkan stok hara dapat disimpan 4 – 8 minggu. Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya dilakukan hanya dengan teknik pengenceran dan pencampuran saja. 

Hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan larutan stok adalah mengenai penyimpanan larutan. Larutan yang sudah mengalami pengendapan tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan larutan stok biasa terjadi bila kepekatan larutan ter-lalu tinggi atau pengadukannya tidak rata. Oleh karena itu pengendapan larutan dapat dihindari dengan membuat larutan stok tidak terlalu pekat dan membuat campuran larutan stok sesuai dengan kelompoknya. Larutan stok dikelompokkan dalam :
  1. Larutan stok A untuk persenyawaan KNO3
  2. Larutan stok B untuk persenyawaan NH4NO3
  3. Larutan stok C untuk persenyawaan KH2PO4 dan MgSO4
  4. Larutan stok D untuk persenyawaan CaCl2
  5. Larutan stok E untuk persenyawaan FeSO4 dan Na2EDTA
  6. Larutan stok F untuk persenyawaan MnSO4, ZnSO4, H3BO3, KI, Na2MoO4, CoCl2, dan CuSO4
  7. Larutan stok G untuk vitamin; thiamine HCl, Nicotinic acid, pyridoxin, dan glycine
  8. Larutan stok H untuk myo inositol


  1. Larutan stok A 1 liter (50 x konsentrasi, ambil 20 ml)
  1. Dalam 1 liter media, KNO3 dibutuhkan sebanyak 1.900 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 50 kali, maka KNO3 yang harus di-larutkan adalah 50 x 1.900 mg/l = 95.000 mg/l atau 95 g/l.
  2. Kemudian larutkan dalam 700 ml aquadest, aduk-aduk sampai larut.
  3. Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.
  4. Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’A’.
  5. Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok A 20 ml.

  1. Larutan stok B 1 liter (50 x konsentrasi, ambil 20 ml)
  1. Dalam 1 liter media, NH4NO3 dibutuhkan sebanyak 1.650 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 50 kali, maka NH4NO3 yang harus dilarutkan adalah 50 x 1.650 mg/l = 82.500 mg/l atau 82,5 g/l.
  2. Kemudian larutkan dalam 700 ml aquadest, aduk sampai larut.
  3. Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.
  4. Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’B’.
  5. Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok B 20 ml.

  1. Larutan stok C 1 liter (100 x konsentrasi, ambil 10 ml)
    1. Dalam 1 liter media, KH2PO4 dibutuhkan sebanyak 170 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 100 kali, maka KH2PO4 yang harus dilarutkan adalah 100 x 170 mg/l =17.000 mg/l atau 17 g/l. MgSO4 dibutuhkan sebanyak 180,5 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 100 kali, maka MgSO4 yang harus dilarutkan adalah 100 x 180,5 mg/l =18.500 mg/l atau 18,5 g/l.
    2. Kemudian larutkan secara terpisah kedua senyawa tersebut dalam 350 ml aquadest, aduk sampai larut.
    3. Setelah larut sempurna, campurkan kedua senyawa tersebut dan tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.
    4. Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’C’.
    5. Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok C 10 ml.

  1. Larutan stok D 1 liter (100 x konsentrasi, ambil 10 ml)
    1. Dalam 1 liter media, CaCl2 dibutuhkan sebanyak 332.02 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 100 kali, maka CaCl2 yang harus di-larutkan adalah 100 x 332,02 mg/l =33.200 mg/l atau 33,2 g/l.
    2. Kemudian larutkan senyawa tersebut dalam 700 ml aquadest, aduk sampai larut.
    3. Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.
    4. Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’D’.
    5. Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok D 10 ml.

  1. Larutan stok E 1 liter (200 x konsentrasi, ambil 5 ml)
    1. Dalam 1 liter media, FeSO4 dibutuhkan sebanyak 27,8 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 200 kali, maka FeSO4 yang harus di-larutkan adalah 200 x 27,8 mg/l = 5.560 mg/l atau 5,56 g/l. Na2EDTA dibutuhkan sebanyak 37,3 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 200 kali, maka Na2EDTA yang harus dilarutkan adalah 200 x 37,3 mg/l =7.460 mg/l atau 7,46 g/l.
    2. Kemudian larutkan secara terpisah kedua senyawa tersebut dalam 350 ml air aquadest yang hangat atau panas dan aduk sampai larut.
    3. Setelah larut sempurna, campurkan Na2EDTA ke dalam botol FeSO4 secara perlahan-lahan sambil diaduk dan tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.
    4. Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’E’.
    5. Erlenmeyer atau botol seluruh sisi-sisinya harus ditutup dengan alumunium foil atau kertas koran, karena larutan Fe ini peka terhadap cahaya.
    6. Setelah dingin, simpan dalam lemari es.
    7. Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok E 5 ml.

  1. Larutan stok F 1 liter (200 x konsentrasi, ambil 5 ml)
  1. Dalam 1 liter media, dibutuhkan MnSO4 16,9 mg/l, ZnSO4 8,6 mg/l, H3BO3 6,2 mg/l, KI 0,83 mg/l, Na2MoO4 0,25 mg/l, CoCl2 0,025 mg/l, dan CuSO4 0,025 mg/l. Untuk larutan stok 1 liter dengan konsentrasi 200 kali, maka bahan-bahan tersebut harus diambil sebanyak; MnSO4 3.380 mg/l, ZnSO4 1.720 mg/l, H3BO3 1.240 mg/l, KI 166 mg/l, Na2MoO4 50 mg/l, CoCl2 5 mg/l, dan CuSO4 5 mg/l.
  2. Timbang dan larutkan senyawa-senyawa tersebut satu persatu sambil diaduk hingga larut dalam 700 ml aquadest. Jangan memasukkan senyawa berikut-nya sebelum senyawa yang diaduk larut.
  3. Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 1 liter.
  4. Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’F’.
  5. Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok F 5 ml.

  1. Larutan stok G 100 ml (100 x konsentrasi, ambil 1 ml)
  1. Dalam 1 liter media, dibutuhkan thiamine 0,1 mg/l, Nicotinic acid 0,5 mg/l, pyridoxin 0,5 mg/l, dan glycine 2 mg/l. Untuk larutan stok 100 ml dengan konsentrasi 100 kali, maka bahan-bahan tersebut harus diambil sebanyak; thiamine 10 mg/l, Nicotinic acid 5 mg/l, pyridoxin 5 mg/l, dan glycine 200 mg/l.
  2. Timbang dan larutkan senyawa-senyawa tersebut satu persatu sambil diaduk hingga larut dalam 50 ml aquadest. Jangan memasukkan senyawa berikutnya sebelum senyawa yang diaduk larut.
  3. Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 100 ml.
  4. Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’G’.
  5. Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok G 1 ml.

  1. Larutan stok H 200 ml (20 x konsentrasi, ambil 10 ml)
  1. Dalam 1 liter media, myo inositol dibutuhkan sebanyak 100 mg/l. Karena larutan stok yang akan dibuat konsentrasinya 20 kali, maka myo inositol yang harus dilarutkan adalah 20 x 100 mg/l = 2.000 mg/l atau 2 g/l.
  2. Kemudian larutkan dalam 100 ml aquadest, aduk sampai larut.
  3. Setelah larut sempurna, tambahkan aquadest sampai volume 200 ml.
  4. Pindahkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan beri label ’H’.
  5. Untuk membuat 1 liter media, ambil larutan stok H 10 ml.

9. Larutan stok zat pengatur tumbuh
Zat pengatur tumbuh, umumnya hanya dibutuhkan dalam jumlah sedikit. Proses penimbangan zat pengatur tumbuh untuk larutan stok, sulit digeneralisasi-kan. Karena biasanya zat pengatur tumbuh merupakan perlakuan dalam media kultur jaringan. Larutan stok dibuat dengan kepekatan 1 – 10 mg/ml. Berikut ini akan diuraikan pembuatan larutan stok zat pengatur tumbuh dengan kepekatan 1 mg/ml sebanyak 100 ml.

a. Larutan stok auksin (IAA, IBA, NAA dan 2,4-D)
Timbang bahan sebanyak 100 mg, kemudian tuangkan ke dalam gelas piala ukuran 100 ml yang berisi aquadest 50 ml. Sambil diaduk-aduk, teteskan sedikit demi sedikit larutan NaOH 1N hingga larut benar. Setelah larut merata, volume ditepatkan 100 ml menambah aquadest. Larutan yang telah ditepatkan volume-nya ini dapat dipindah ke botol lain dan diberi label. Untuk membuat 1 liter media dengan perlakuan hormon auksin 1 ppm, maka dibutuhkan 1 ml larutan stok hormon.

b. Larutan stok sitokinin (BAP, dan kinetin)
Timbang bahan sebanyak 100 mg, kemudian tuangkan ke dalam gelas piala ukuran 100 ml yang berisi aquadest 50 ml. Sambil diaduk-aduk, teteskan sedikit demi sedikit larutan HCl 1N hingga larut benar. Setelah larut merata, volume ditepatkan 100 ml menambah aquadest. Larutan yang telah ditepatkan volume-nya ini dapat dipindah ke botol lain dan diberi label. Untuk membuat 1 liter media dengan perlakuan hormon sitokinin 1 ppm, maka dibutuhkan 1 ml larutan stok hormon.
Apabila hormon sukar untuk larut, aquadest dapat dipanaskan sampai men-didih terlebih dahulu. Kemudian digunakan untuk melarutkan hormon dengan ditambahkan zat pelarut (HCl atau NaOH) sedikit demi sedikit sambil diaduk hingga larut.


STERILISASI ALAT-ALAT DAN MEDIA TANAM

Alat-alat yang dipakai ketika penanaman harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam, gelas dan media tanam disterilkan dengan autoclave. Berikut tabel standart waktu, tekanan dan suhu untuk sterilisasi dengan menggunakan autoklaf :

No
Obyek sterilisasi
Waktu
(menit)
Tekanan yang dipakai
Suhu
(oC)
Mpa
Kg/cm2
psi
1
Botol kosong
20-40
0.105-0.14
1.05-1.4
15-20
121-126
2
Media tanam
20
0.105-0.14
1.05-1.4
15-20
121-126
3
Air steril
60
0.105-0.14
1.05-1.4
15-20
121-126
4
Peralatan tanam
20-40
0.105-0.14
1.05-1.4
15-20
121-126
5
Media kontaminan
60
0.105-0.14
1.05-1.4
15-20
121-126
Autoklaf yang dapat digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang sederhana sampai yang progamable. Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber panas dengan menggunakan kompor gas. Pada autoklaf yang sederhana ini, tekanan dan suhu diatur dengan membesarkan atau mengecilkan sumber api. Kelemahan autoklaf ini adalah perlunya penjagaan dan pengaturan panas secara manual selama masa sterilisasi dilakukan. Keuntungan penggunaan autoklaf ini adalah sederhana pengoperasianya, harganya relatif murah, tidak tergantung pada aliran listrik, dan lebih cepat masak dibandingkan dengan autoklaf listrik.
Autoklaf yang progamable menggunakan sumber energi dari listrik. Alatnya dilengkapi dengan timer dan thermostat. Bila pengatur automatik ini berjalan dengan baik, maka autoklaf ini dapat dijalankan sambil mengerjakan pekerjaan lain. Ke-lemahannya adalah bila salah satu pengatur tidak bekerja, maka pekerjaan persiapan media menjadi sia-sia dan kemungkinan menyebabkan kerusakan total pada autoklaf.
Berikut adalah prosedur sterilisasi dengan autoklaf sederhana (gas) :
  1. Autoklaf di isi air sampai batas ”sang-sang atau sarangan”.
  2. Kemudian botol dimasukkan sampai penuh dan tutup rapat, dengan posisi katup ’release valve’ terbuka dan ’savety valve’ tertutup.
  3. Nyalakan kompor gas dengan nyala api besar.
  4. Tunggu sampai air mendidih dan keluar tekanan uap dari katup ’release valve’, kemudian tutup katup tersebut.
  5. Biarkan tekanan naik sampai pada tekanan 0.14 Mpa.
  6. Kecilkan api kompor dan jaga jarum penunjuk tekanan pada angka 0.14 Mpa dan hitung waktunya.
  7. Waktu untuk autoklaf media tanam 20 menit, air steril 1 jam, botol kosong dan alat-alat tanam 30 – 45 menit serta botol kontaminan 1 jam.
  8. Apabila waktu sterilisasi sudah tercapai, matikan kompor dan biarkan tekanan turun dengan sendirinya ke angka nol.
  9. Buka terlebih dahulu katup ’release valve’, kemudian baru buka tutup autoklaf.
Sumber : Bahan ajar Buku Pembibitan Kultur Jaringan Tanaman
                Modul : PKJT kls XII semester 1

Posting Komentar untuk "(KLS XII BAB 1) TEKNIK PENYIAPAN PERALATAN KULTUR JARINGAN TANAMAN"