Menganalisis teknik sterilisasi ruang, alat, dan bahan kultur jaringan tanaman hortikultura

Kd 3.15 Menganalisis teknik sterilisasi ruang, alat, dan bahan kultur jaringan tanaman hortikultura

Sterilisasi adalah segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril. Peralatan yang kami gunakan yaitu petridish yang berfungsi untuk media pemotongan hasilnya steril karena dalam mensterilisasi sesuai petunjuk. Alat yang kedua yaitu botol kultur yang berfungsi untuk menaruh penanaman eksplan hasilnya juga steril karena sangat hati-hati dalam melakukan sterilisasi. Peralatan yang ketiga yaitu Erlenmeyer yang berfungsi untuk pencucian,hasilnya juga steril karena dalam melakukan pensterilan dilakukan dengan sungguh-sungguh dan menjaga kondisi lingkungan tetap steril. Peralatan yang keempat yaitu scalpel yang berfungsi untuk memotong eksplan,hasil alat tersebut juga steril karena praktikan dalam melakukan sterilisasi selalu dalam keadaan steril dan berhati-hati. Peralatan yang ke lima yaitu pinset yang berfungsi untuk mengambil eksplan,hasil alatnya juga steril karena dalam melakukan pensterilan dilakukan sesuai petunjuk dan keadaan lingkungan serta praktikan steril sehingga tidak ada bakteri yang masuk. Peralatan yang ke enam yaitu aluminium foil yang berfungsi untuk membungkus botol kultur,hasilnya alat tersebut juga steril karena praktikan menggunakan dengan hati-hati dan cermat.

Salah satu faktor penentu keberhasilan kultur jaringan adalah tahap sterilisasi. Kegiatan sterilisasi ini meliputi pada:

1. Sterilisasi pada lingkungan kerja.
2. Sterilisasi pada alat-alat dan media tanam.
3. Sterilisasi bahan tanaman (eksplan).

Kegiatan sterilisasi ini sangat penting untuk dilakukan, karena kontaminasi pada kultur jaringan dapat berasal dari:

1. Eksplan, baik kontaminasi eksternal maupun internal.
2. Organisme kecil yang masuk ke dalam media, seperti semut.
3. Botol kultur atau alat-alat yang kurang steril.
4. Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor.
5. Kecerobohan dalam bekerja.

Dalam sterilisasi bahan tanaman, hal yang penting yang harus mendapat perhatian adalah; bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama-sama benda hidup. Kontaminan harus dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman.

Beberapa jenis bahan disenfektan yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman :

No	Bahan	Konsentrasi	Lama perendaman
1	Kalsium hipoklorit	1 – 10 %	5 – 30 menit
2	Natrium hipoklorit	1 – 2 %	7 – 15 menit
3	Hidrogen peroksida	3 – 10 %	5 – 15 menit
4	Perak nitrat	1 %	5 – 30 menit
5	Merkuri klorit (HgCl2)	0.1 – 0.2 %	10 – 20 menit
6	Bethadine	2.5 – 10 %	5 – 10 menit
7	Fungisida	2 g/l	20 – 30 menit
8	Antibiotik	50 – 100 mg/l	½ - 1 jam
9	Alkohol	70 %	1 – 10 menit
10	Bayclin/sunclin	5 – 30 %	5 – 25 menit

Bahan-bahan sterilisasi ini pada umumnya bersifat toxic/racun terhadap jaringan tanaman. Pembilasan yang berkali-kali sesudah perendaman eksplan di dalam larutan bahan streilisasi, sangat diperlukan untuk menghilangkan sisa-sisa bahan aktif yang masih menempel dipermukaan bahan tanaman.

Dalam sterilisasi, kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan sterilisasi. Misalnya; perendaman dalam alkohol dulu, kemudian dalam bayclin, setelah itu bilas dengan air steril. Dapat juga perendaman di mulai dengan larutan fungisida atau antibiotik, kemudian baru HgCl₂ dan dibilas dengan air steril. Prosedur mana yang efektif, harus ditentukan melalui percobaan pendahuluan.

Sterilisasi bahan tanaman dimulai dengan pencucian dan pembuangan bagian-bagian yang kotor dan mati di bawah pancuran air bersih. Pencucian dapat dilakukan dengan penyikatan menggunakan detergent halus. Kadang-kadang bahan yang sudah bersih dibiarkan dibawah pancuran air selama 30 menit. Hal ini dilakukan untuk memecah koloni kontaminan yang masih menempel dipermukaan agar koloni tersebut lebih peka terhadap bahan-bahan sterilisasi. Juga untuk mengurangi dan menghilangkan senyawa fenol, terutama pada tanaman yang kandungan fenoliknya tinggi.

Bahan yang sudah bersih dikecilkan sampai ukuran tertentu. Ukuran ini harus lebih besar dari ukuran eksplan yang direncanakan. Bahan kemudian direndam dalam larutan fungisida/antibiotik. Setelah waktu perendaman tercapai, bahan dicuci bersih dan ditiriskan, kemudian bawa masuk ke dalam laminar. Di dalam laminar eksplan direndam dalam alkohol 70 % selama 1 – 2 menit, dan dibilas dengan air steril sekali. Kemudian rendam eksplan dalam larutan bayclin 20 % + tween-20 2 tetes selama 10 menit. Tween-20 ini berfungsi sebagai perekat. Setelah waktu pe-rendaman tercapai, eksplan dibilas dengan air steril 3 – 5 kali selama 5 menit untuk tiap-tiap pembilasan dan letakkan di dalam petridish yang dialasi tissue steril. Bila semua prosedur sudah dilakukan, berarti bahan tanaman sudah siap di tanam pada media kultur.

Prosedur sterilisasi dapat dimodifikasi sesuai dengan kebutuhan, seperti :

1. Fungisida – alkohol – bayclin – bayclin – aquades steril
2. Alkohol – bayclin – bayclin – aquades steril
3. HgCl₂ – alkohol – aquades steril
4. Fungisida – bayclin – bayclin – bayclin – aquades steril
5. dll

Sterilisasi alat – alat gelas

Botol kultur biasanya kecil potensinya sebagai penyebab kontaminasi, karena selalu diautoklaf dengan media.  Alat gelas lain dapat disterilisasi dengan beberapa cara, misalnya ekspos ke radiasi UV, penggunaan larutan desinfestasi atau lebih mudah dengan mengautoklaf atu dengan pemanasan dalam oven pada 180oC selama minimal 3 jam.  Alat – alat plastik seperti polypropylene atau polycarbonate mesti disterilisasi dengan autoklaf karena mereka tidak tahan panas kering pada 180oC.  Wadah plastic dapat digunakan berulangkali; karena mereka tahan diautoklaf berulangkali tapi akhirnya menjadi sedikit mengkerut (brittle).

Untuk sterilisasi panas kering (dalam oven), peralatan seperti scalpel, gunting dan forsep, petri dish, beaker dll, dapat dibungkus dengan kertas atau aluminium foil terlebih dahulu sebelum diautoklaf.  Kertas yang diautoklaf kemudian dikeringkann dengan cara meletakkan pada oven dengan suhu 60 – 70oC atau di dalam laminar air flow cabinet sebelum digunakan.

Teknik Sterilisasi – manipulasi bahan tanaman

Sumber utama kontaminan adalah spora jamur dan bakteri yang membentuk bagian alami dari atmosfer.  Dapat diasumsikan bahwa agen kontaminasi ada dimana – mana, misalnya pakaian, kulti, rambut dan nafas si operator, jaringan tanaman, peralatan, bagian luar wadah kultur, permukaan tempat kerja, dan banyak lagi. Udara steril di dalam laminar air flow cabinet memungkinkan kita untuk dengan mudah membuka wadah kultur dan bekerja secara steril.

Peralatan dapat disterilisasi dengan mencelupkan pada alcohol 70 – 80% yang diikuti dengan pembakaran (flaming) menggunakan Bunsen burner atau lampu spiritus.  Bleach dapat juga digunakan sebagai alternatif untuk mensterilisasi peralatan dengan alcohol.  Larutan klorin encer (0.1 – 0.25% klorin) dapat digunakan.  Peralatan harus stainless steel, karena bahan lain akan berkarat dengan cepat jika direndam dalam bleach.

Secara ringkas langkah berikut mesti dilakukan jika melakukan kegiatan kultur jaringan:

1. Semprot atau usap baigan dalam laminar flow cabinet dengan 70% etil atau isopropyl alcohol sebelum menghidupkan cabinet.  Alcohol 70% penting dinguankan, absolute alcohol (95%) tidak membunuh mikroba)
2. Hidupkan cabinet.  Jika anda menggunakan lampu UV pastikan anda sudah mematikannya sebelum meletakkan bahan tanaman di dalam cabinet.
3. Semprot semua wadah dan bahan dengan ethanol 70% sebelum meletakkannya dalam cabinet.
4. Cuci tangan dan lengan dengan sabun dan air dan usap dengan 70% ethanol sebelum mengambil tanaman.  Penting dicatat bahwa ethanol memiliki efek residual; karenanya sebaiknya menggunakan Hexifoam (desinfektan untuk kulit).
5. Jika menggunakan api, berhati-hatilah
6. Atur ruang kerja dalam cabinet sehingga tidak banyak gerakan tangan menyilang di dalam cabinet.
7. Jika bahan tanaman jatuh ke permukaan cabinet, anggap terkontaminasi dan buang
8. Setelah selesai mentransfer kultur, matikan cabinet, semprot atau usap dengan 70% ethanol dan tutup cabinet.

Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara:

a.  Sterilisasi dengan pembakaran

Alat-alat yang terbuat dari logam dapat disterilkan dengan cara memanaskan atau membakar di atas lampu spirtus.

b.  Sterilisasi dengan udara panas/kering

Alat-alat dari gelas seperti cawan petri, erlenmeyer, tabung piala, botol eksplan, tabung reaksi dan sebagainya dapat disterilkan dengan udara panas (oven) pada suhu 130 – 160^o C selama 1 – 2 jam. Alat alat ditata tidak terlalu rapat agar sirkulasi udara antar tumpukan alat dapat berjalan lancar, sehingga semua alat dapat disterilkan dan dapat dengan mudah dijaga kesterilannya saat dikeluarkan dari alat sterilisasi.

c.  Sterilisasi dengan uap panas (basah)

Bahan atau alat dapat disterilkan dengan uap panas atau secara basah pada uap panas biasa atau uap panas dengan tekanan tinggi, secara terus menerus (kontinyu) atau secara terputus putus (diskontinyu), khususnya medium pada suhu atau tekanan yang rendah. Untuk sterilisasi dengan cara ini sering kali menggunakan otoklaf. Sterilisasi medium biasanya dilakukan pada suhu 121^oC dengan tekanan 1 atm selama 15-30 menit, namun untuk medium yang tidak mudah rusak dapat dilakukan pada suhu atau tekanan yang sedikit lebih tinggi.

d.  Sterilisasi dengan bahan kimia

Bahan kimia tertentu sering digunakan untuk sterilisasi alat maupun bahan. Etanol 70% sering digunakan untuk sterilisasi permukaan pada alat yang sering dikombinasi dengan pembakaran pada api. NOCl (natrium hipoklorit) dan formalin juga sering digunakan untuk sterilisasi permukaan atau disinfestasi permukaan atau disinfeksi permukaan.

e.   Sterilisasi lingkungan kerja

Lingkungan kerja untuk teknik kultur jaringan dapat dibagi atas lingkungan umum dan lingkungan spesifik. Lingkungan umum adalah ruangan transfer secara keseluruhan, sedangkan lingkungan spesifik adalah lingkungan didalam laminar air flow cabinet dimana proses penanaman eksplan dan prosedur lain seperti isolasi protoplasma dilakukan.

f.   Sterilisasi alat-alat dan media

Alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah: pinset, gunting, gagang scalpel, petridisk, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel.

Media dan aquades juga disterilkan dalam autoclave.Untuk aquades sebaiknya dimasukkan dalam wadah kecil misalnya elemeyer 250 ml dengan isi maksimum 100 ml, agar sterilisasi lebih efektif. Untuk media kultur yang tidak mengandung bahan-bahan yang heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan autoclave pada suhu 121⁰C. 

g.  Sterilisasi bahan tanaman

Pada setiap jenis tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari dalam jaringan tanaman, terutama bakteri.Bakteri-bakteri ini sampai sekarang belum diidentifikasi.Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah.Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotik atau fungisida yang sistemik.

Setiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminasi yang berbeda tergantung dari :

a.      Jenis tanaman

b.      Bagian tanaman yang diperlukan

c.      Morfologi permukaan

d.      Lingkungan tumbuhnya

e.      Umur tanaman

f.      Kondisi tanaman

g.      Musim waktu mengambil

Sumber kontaminasi dapat barasal dari :

     1.      Eksplan, baik kontaminasi eksternal maupun internal

     2.      Organisme kecil yang masuk ke dalam media. Dengan keadaan di Indonesia, yang pling sering menyebabkan kontaminasi adalah semut.

3.      Botol kultur atau alat-alat yang kurang steril.

4.      Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor (spora di udara)

5.      Kecerobohan dalam pelaksanaan.

Seperti yang dijelaskan diatas, alat-alat yang perlu disterilkan sebelum penanaman adalah : pinset, gunting, gagang scalpel, kertas saring, petri dish, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel. Alat-alat dan kertas saring dibungkus rapi dengan kertas tebal atau ditaruh dalam baki stainless steel dan bakinya dibungkus dengan kain tebal sebelum dimasukkan ke dalam autoclave. Alumunium foil tidak direkomendasikan sebagai pembungkus, karena uap tidak dapat masuk ke dalam bungkusan. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah 121⁰ C pada tekanan 17,5 psi (pounds per squareinch) selama 1 jam. Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.

Alat-alat yang dipakai ketika penanaman harus dalam keadaan steril.Alat-alat logam dan dapat disterilisasikan dalam autoclave. Alat tanam seperti : pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan, namun pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam suhu tinggi, oleh karena itu untuk bladenya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit (Syahmi edi, 2007)

Dalam sterilisasi alat, ada 2 macam Sterilisasi, yaitu :

1.      Sterilisasi luar :

o   Sterilisasi luar merupakan sterilisasi alat-alat dengan menggunakan deterjen/sabun dan air yang mengalir. Botol-botol kultur dicuci dengan cara menggosok seluruh bagian botol (dalam dan luar) dengan menggunakan deterjen/sabun.

o   Kemudian membilas botol-botol kultur tersebut dengan air yang mengalir sampai air mengenai seluruh bagian botol dan membersihkan bekas-bekas deterjen/sabun.

o   Setelah dibilas dengan air mengalir, botol diletakkan ditempat yang sudah disemprot dengan  alkohol

2.   Sterilisasi dalam :

o   Sterilisasi dalam dilakukan dengan cara memasukkan botol-botol kultur ke dalam autoclave. Alat-alat yang disterilisasi dengan autoclave adalah alat yang berupa logam dan gelas.

o   Botol-botol kultur dan alat-alat tanam yang dibungkus dengan kertas dimasukkan kedalam autoclave selama 1 jam. Suhu yang digunakan untuk sterilisasi adalah 121⁰C karena pada suhu tinggi tersebut mikroba akan mati pada tekanan 17,5 psi (pounds per squareinch).

o   Perhitungan waktu sterilisasi dimulai setelah tekanan yang diinginkan tercapai.

Pada prinsipnya, peralatan yang digunakan dalam praktikum ini haruslah steril. Karena peralatan yang tidak steril akan dapat menjadi sumber kontaminan sehingga menggagalkan percobaan kultur jaringan yang dilakukan.

Selain peralatan seperti : pinset, gunting, gagang scalpel, petridisk, botol-botol kosong, jarum suntik untuk isolasi meristem dan pipet untuk memindahkan suspensi sel, media dan aquades yang digunakan juga harus disterilisasi. Namun terkadang hal itu saja tidaklah cukup karena sterilisitas dari praktikan juga sangat mempengaruhi. Jadi apabila praktikan akan melakukan percobaan, maka praktikan harus membersihkan dirinya terlebih dahulu. Diantaranya praktikan dapat melakukan hal-hal sebagai berikut : mandi, mencuci tangan dan kaki dengan sabun, mengganti pakaian yang bersih atau pakaian khusus praktik, dan usaha-usaha lain yang dapat menghindarkan kontaminasi.